Technika histochemiczna

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Spis tre
Ś
ci:
Mikroskopy
ś
wietlne - 7
2.
Mikroskopy elektronowe - 23
3.
–
4.
Przygotowanie materiału do bada
ń
w mikroskopie elektronowym - 69
5.
Technika mro
ż
eniowa - 88
6.
Podstawy cytochemii i histochemii - 100
Podstawy immunohistochemii - 121
8.
Hybrydocytochemia (hybrydyzacja
IN SITU
) - 142
9.
–
10.
Hodowla komórek i tkanek - 164
11.
Analiza ilo
ś
ciowa preparatów mikroskopowych - 176
1.
7.
1. MIKROSKOPY
Ś
WIETLNE
Mikroskopy
ś
wietlne (optyczne) wykorzystuj
ą
widzialne pasmo fal elektromagnetycznych i
umo
ż
liwiaj
ą
uzyskiwanie powi
ę
ksze
ń
rz
ę
du 10-1500 ×.
1.1. Budowa mikroskopu
ś
wietlnego
W skład ka
ż
dego mikroskopu
ś
wietlnego wchodz
ą
dwa zespoły cz
ęś
ci: zespół mechaniczny i
zespół optyczny.
1.1.1. Zespół mechaniczny
Zespół mechaniczny zbudowany jest z nast
ę
puj
ą
cych elementów:
•
podstawa mikroskopu
, z reguły masywna, zapewniaj
ą
ca jego stabilno
ść
;
•
statyw
, do którego przymocowany jest stolik przedmiotowy i tubus (p. dalej);
•
stolik przedmiotowy
, posiadaj
ą
cy w
ś
rodku okr
ą
gły otwór dla przej
ś
cia wi
ą
zki promieni
ś
wietlnych. Stolik wyposa
ż
ony jest w poruszane współosiowymi pokr
ę
tłami prowadnice,
umo
ż
liwiaj
ą
ce przesuwanie preparatu w dwóch prostopadłych do siebie kierunkach. Dodatkowa
kalibracja (na prowadnicach lub pokr
ę
tłach) pozwala na liczbowe okre
ś
lenie współrz
ę
dnych
dowolnego miejsca w preparacie i szybkie odszukanie go przy powtórnym ogl
ą
daniu;
•
tubus
, na którego przeciwległych ko
ń
cach zamocowane s
ą
podstawowe elementy optyczne
tworz
ą
ce obraz: okular i obiektyw. We współczesnych mikroskopach stosuje si
ę
tzw. tubus
łamany, w którym osie optyczne obiektywu i okularu tworz
ą
ze sob
ą
pewien k
ą
t, co umo
ż
liwia
wygodne mikroskopowanie;
•
rewolwer
- obrotowa tarcza znajduj
ą
ca si
ę
na dolnym ko
ń
cu tubusa, do której wkr
ę
ca si
ę
3-6
7
obiektywów. Dzi
ę
ki obecno
ś
ci mechanizmu zatrzaskowego umo
ż
liwia szybkie ustawienie
po
żą
danego obiektywu w osi optycznej (zmian
ę
powi
ę
ksze
ń
);
•
ś
ruba makrometryczna i mikrometryczna
. Precyzyjne ustawienie ostro
ś
ci obrazu wymaga
regulacji odległo
ś
ci pomi
ę
dzy preparatem a obiektywem, czyli pomi
ę
dzy stolikiem
przedmiotowym a tubusem. W zale
ż
no
ś
ci od konstrukcji mikroskopu elementem ruchomym
mo
ż
e by
ć
b
ą
d
ź
stolik b
ą
d
ź
tubus, a przesuwu dokonuje si
ę
za po
ś
rednictwem dwóch zazwyczaj
współosiowych pokr
ę
teł umieszczonych w statywie mikroskopu:
ś
ruby makrometrycznej
(szybkiego przesuwu) oraz mikrometrycznej (wolnego przesuwu). W niektórych mikroskopach
stosuje si
ę
tylko jedno pokr
ę
tło (wolnego przesuwu).
1.1.2. Zespół optyczny
W skład zespołu optycznego wchodz
ą
:
•
ź
ródło
ś
wiatła
. Mikroskopy badawcze posiadaj
ą
wbudowane w podstaw
ę
własne
ź
ródło
ś
wiatła (
ż
arówk
ę
halogenow
ą
lub ksenonow
ą
) o regulowanej jaskrawo
ś
ci
ś
wiecenia,
wyposa
ż
one w przesłon
ę
. Mikroskopy szkolne wyposa
ż
one s
ą
w dwustronne lusterko mog
ą
ce
obraca
ć
si
ę
we wszystkich płaszczyznach. Za jego po
ś
rednictwem mo
ż
na korzysta
ć
z
zewn
ę
trznych
ź
ródeł
ś
wiatła (
ś
wiatło dzienne lub lampa);
•
filtry
. Mikroskopy badawcze wyposa
ż
one s
ą
w kilka barwnych filtrów (niebieski, zielony,
ż
ółty, czerwony), pomocnych przy kontrastowaniu obrazu mikroskopowego i przy
wykonywaniu mikrofotografii, a tak
ż
e w filtr ciemny (szary), zmniejszaj
ą
cy jaskrawo
ść
obrazu
przy ni
ż
szych powi
ę
kszeniach;
•
przesłona
, umieszczona z reguły przed (pod) kondensorem pozwala na regulacj
ę
jasno
ś
ci
pola widzenia i kontrastowo
ś
ci obrazu;
•
kondensor
. Jest to układ soczewek skupiaj
ą
cy wi
ą
zk
ę
promieni
ś
wietlnych wysyłanych ze
8
ź
ródła
ś
wiatła, w celu o
ś
wietlenia pola widzenia w preparacie. Apertura numeryczna
kondensora powinna by
ć
zgodna z apertur
ą
obiektywu (p. dalej). Kondensor mo
ż
na przesuwa
ć
pionowo za pomoc
ą
odr
ę
bnego pokr
ę
tła, co umo
ż
liwia regulacj
ę
o
ś
wietlenia pola widzenia;
operuj
ą
c kondensorem i przesłon
ą
mo
ż
na ustawi
ć
optymalne o
ś
wietlenie preparatu, tzw.
o
ś
wietlenie Köhlera (w nowoczesnych mikroskopach uzyskuje si
ę
je automatycznie),
•
obiektyw
- jeden z dwóch (oprócz okularu) elementów tworzenia obrazu powi
ę
kszonego. Jest
to układ soczewek dobranych w ten sposób, aby zniwelowa
ć
wady optyczne pojedynczej
soczewki: aberracj
ę
sferyczn
ą
i chromatyczn
ą
1
.
W zale
ż
no
ś
ci od stopnia i sposobu korekcji tych wad wyró
ż
nia si
ę
kilka typów
obiektywów:
-
obiektywy monochromatyczne
: ze skorygowan
ą
aberracj
ą
chromatyczn
ą
w zakresie
okre
ś
lonej cz
ęś
ci widma
ś
wiatła białego;
-
obiektywy achromatyczne
: ze skorygowan
ą
aberracj
ą
chromatyczn
ą
w zakresie
ś
rodkowej
cz
ęś
ci widma
ś
wiatła białego;
-
obiektywy planachromatyczne
: jw., z dodatkowo skorygowan
ą
aberracj
ą
sferyczn
ą
;
-
obiektywy apochromatyczne
: ze skorygowan
ą
aberracj
ą
chromatyczn
ą
w zakresie prawie
całego widma
ś
wiatła białego;
-
obiektywy planapochromatyczne
: jw., z dodatkowo skorygowan
ą
aberracj
ą
sferyczn
ą
.
Obiektywy planachromatyczne i planapochromatyczne pozwalaj
ą
na korzystanie z
du
ż
ego pola widzenia i okularów o znacznych powi
ę
kszeniach.
Obiektywy mo
ż
na równie
ż
podzieli
ć
na tzw.
obiektywy suche
(małych i
ś
rednich
powi
ę
ksze
ń
) oraz
obiektywy immersyjne
(du
ż
ych powi
ę
ksze
ń
). Przy u
ż
ywaniu tych ostatnich
1
Aberracja sferyczna - poszczególne współosiowe strefy soczewki nieznacznie ró
ż
ni
ą
si
ę
swoimi ogniskowymi;
powoduje to w efekcie nieostro
ść
obrazu. Aberracja chromatyczna - współczynnik załamania
ś
wiatła materiału
soczewki zmienia si
ę
w zale
ż
no
ś
ci od długo
ś
ci przechodz
ą
cej fali
ś
wietlnej; efektem tego jest rozszczepienie
przechodz
ą
cego
ś
wiatła białego i pojawienie si
ę
barwnych obwódek wokół konturów obrazu, co pogarsza jego
jako
ść
.
9
nale
ż
y wypełni
ć
przestrze
ń
pomi
ę
dzy preparatem a soczewk
ą
czołow
ą
obiektywu olejkiem
immersyjnym, którego współczynnik załamania
ś
wiatła jest taki sam, jak współczynnik szkła.
Unika si
ę
w ten sposób ugi
ę
cia (dyfrakcji) promieni
ś
wietlnych na granicy szkła i powietrza,
które przy du
ż
ych powi
ę
kszeniach niekorzystnie wpływa na jako
ść
obrazu.
Na obudowie ka
ż
dego obiektywu znajduj
ą
si
ę
podstawowe dane dotycz
ą
ce jego
charakterystyki: powi
ę
kszenie oraz apertura numeryczna (p. dalej). Najcz
ęś
ciej stosowane
powi
ę
kszenia obiektywów to: 5, 10, 20, 40 (suche), 60 i 90-100 × (immersyjne);
•
po
ś
rednie układy optyczne
. Pomi
ę
dzy obiektywem a okularem znajduj
ą
si
ę
zazwyczaj tzw.
po
ś
rednie układy optyczne, zale
ż
ne od typu i konstrukcji mikroskopu. Najcz
ęś
ciej spotykamy
zwierciadła załamuj
ą
ce promienie
ś
wietlne pod okre
ś
lonym k
ą
tem, zgodnym z k
ą
tem załamania
tubusa. W mikroskopach badawczych montuje si
ę
tak
ż
e układy pryzmatów lub
półprzepuszczalnych luster rozdzielaj
ą
cych promienie na dwie odr
ę
bne wi
ą
zki daj
ą
ce taki sam
obraz: jedn
ą
skierowan
ą
do okularu, a drug
ą
do poł
ą
czonego z mikroskopem urz
ą
dzenia
peryferyjnego (np. aparat fotograficzny, kamera cyfrowa, wideokamera). Mog
ą
si
ę
tu równie
ż
znajdowa
ć
soczewki dodatkowo powi
ę
kszaj
ą
ce obraz odbierany przez urz
ą
dzenie peryferyjne,
b
ą
d
ź
przez okular.
•
okular:
ostatni element zespołu optycznego. Jest to układ soczewek działaj
ą
cy na zasadzie
lupy, za pomoc
ą
którego ogl
ą
dany jest obraz mikroskopowy. Powi
ę
kszenie okularu (5-15 ×)
oznaczone jest na jego obudowie. Specjaln
ą
odmian
ę
stanowi
ą
okulary zapewniaj
ą
ce
szczególnie du
ż
e pole widzenia. W najprostszych mikroskopach szkolnych stosuje si
ę
pojedynczy okular. W mikroskopach badawczych u
ż
ywa si
ę
okularu podwójnego (binokularu)
o regulowanym rozstawie, który umo
ż
liwia wygodniejsze i mniej m
ę
cz
ą
ce wzrok obuoczne
ogl
ą
danie obrazu.
Elementy składowe mikroskopu
ś
wietlnego przedstawia ryc. 1.1.
10
[ Pobierz całość w formacie PDF ]