Techniki elektroforetyczne wstep ...

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
I.
ELEKTROFOREZA – OPIS FIZYCZNY
ELEKTROFOREZA
- metoda analizowania i rozdzielania koloidów, wykorzystująca ruch
naładowanych cząstek koloidowych w polu elektrycznym.
Wielkością referencyjną występującego zjawiska jest ruchliwość elektroforetyczna, która określa
prędkość przemieszczania się cząstek na jednostkę natężenia pola:
(1)
u - ruchliwość elektroforetyczna (C·s/kg)
v -prędkość cząstki (m/s)
E - natężenie pola elektrycznego (N/C)
lub uwzględniając wielkości dostępne w pomiarach :
(2)
gdzie:
s- droga migracji cząstki [m]
l- długość nośnika podziału [m]
t- czas trwania elektroforezy [s]
U- przyłożona różnica potencjałów
Elektroforezę przeprowadza się stosując natężenie pola w zakresie do 10 V/m (elektroforeza
niskonapięciowa) lub w warunkach chłodzenia przy natężeniu pola około 100V/m (elektroforeza
wysokonapięciowa).
Analizę zjawiska elektroforezy można przeprowadzić na przykładzie analogii do spadku bańki
mydlanej w powietrzu. W tym przypadku mamy do czynienia z obiektem sferycznym o promieniu a
poddanemu działaniu siły grawitacyjnej Fg
(3)
F
g
- siła grawitacyjna (N)
m - masa bańki (kg)
g - przyspieszenie ziemskie (m/s
2
)
Przy założeniu, że jest to jedyna działająca siła bańka będzie poruszać się ruchem jednostajnie
przyspieszonym. Ale obserwacja pokazuje, że tak w rzeczywistości nie jest. Istnieje siła tarcia Ft
przeciwdziałająca sile grawitacyjnej, związana z lepkością powietrza. Siła ta zwiększa się z prędkością
v bańki i jej wartość opisuje prawo Stokes'a :
(4)
F - siła tarcia (N)
η - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s
2
)
v - prędkość (m/s)
1
W czasie przyspieszania bańka osiągnie pewien punkt, w którym F
t
zrówna się z F
g
. Potem nie
obserwuje się dalszego przyspieszania i bańka porusza się ze stałą prędkością V
t
, którego wartość jest
zdeterminowana warunkiem F
g
+ F
t
= 0 i przedstawia się następująco:
(5)
V
t
- prędkość bańki (m/s)
m - masa bańki (kg)
η - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s
2
)
u - ruchliwość elektroforetyczna (C·s/kg)
g - przyspieszenie ziemskie (m/s
2
)
Zamiast siły grawitacyjnej Fg = m·g [m.- masa cząstki (g), g- przyciąganie ziemskie (m/s)]
przyjmujemy siłę elektryczną Fe = Q·E [Q- ładunek elektryczny (C), E
e
- natężenie pola elektrycznego
(N/C)]. Możemy zatem przypuszczać, że wzór na prędkość dla cząstki naładowanej w polu
elektrycznym będzie się przedstawiał następująco:
(6)
η - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s
2
)
Q - ładunek cząstki (C)
E - natężenie pola elektrycznego (N/C)
Nie jest to poprawne ze względu na chmurę jonów otaczających naładowaną cząstkę. Ta chmura ma
ładunek przeciwny, ale równy co do wartości ładunkowi cząstki i pod wpływem zewnętrznego pola
elektrycznego przemieszcza się w przeciwnym kierunku. Energia związana z przemieszczającą się
chmurą jest częściowo przekazywana do otaczającego ją środowiska, a więc również do naładowanej
cząstki. Przyjmując za punkt odniesienia poruszającą się cząstkę, możemy zauważyć nieruchomą sferę
z roztworem elektrolitu opływającym ją z prędkością - V
t
. Zilustrowano to na rysunku 1, gdzie
przyjęto , że cząstka przenosi ładunek dodatni , a natężenie ma zwrot w prawo. Dla przypadku cząstki
naładowanej ujemnie natężenie ma zwrot przeciwny.
Rys. 1
Model przepływu elektrolitu wokół naładowanej cząstki.
2
II.
ELEKTROFOREZA KWASÓW NUKLEINOWYCH
Elektroforeza jest obecnie jedną z głównych metod identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania
kwasów nukleinowych. Do rozdzielania dużych cząsteczek DNA stosuje się elektroforezę w żelu
agarozowym. Do rozdzielania małych fragmentów DNA stosuje się elektroforezę w żelu
poliakrylamidowym. W wersji podstawowej są to proste i szybkie techniki, umożliwiające
rozdzielenie mieszaniny różnych fragmentów DNA. Prążki DNA w żelu barwi się przy użyciu bardzo
małych stężeń barwnika fluoryzującego – np. bromku etydyny, wbudowującego się między zasady
(interkalacja). Już nawet kilkadziesiąt ng DNA można wykryć bezpośrednio w żelu w świetle lampy
UV.
A.
Elektroforeza w żelu agarozowym
.
Agaroza - polisacharyd rozpuszczony w roztworze wodnym tworzy stały żel. Jest to frakcja agaru
oczyszczona z krasnorostów. Polisacharyd ten zbudowany jest z około 800 liniowo połączonych reszt
heksozy (inaczej 400 reszt agarobiozy). Agarobioza to dwucukier zbudowany z D-galaktozy i 3,6-
anhydro-L-galaktozy. Powstawanie żelu agarozowego jest reakcją odwracalna, w wyniku której
pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę III-rzędową.
Łańcuchy te rozgałęziając się tworzą sieć. Wielkość porów żelu agarozowego zależy od stężenia
agarozy i określa zakres ciężaru makrocząsteczek np. DNA czy RNA, które można w niej
elektroforetycznie rozdzielać.
Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo (Rys.2). Próbki
DNA umieszczane są w kieszonkach formowanych w żelu, włączane jest źródło prądu i DNA może
się przemieszczać poprzez żel w osobnych ścieżkach. Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w
środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w
kierunku anody.
Rys.2
Aparat do elektroforezy w żelu agarozowym.
Kiedy poddamy żel działaniu pola elektrycznego w obecności buforu, który przewodzi prąd
elektryczny, fragmenty DNA migrują w żelu w kierunku elektrody dodatniej (DNA ma silny ładunek
ujemny) z szybkością zależną od ich wielkości i kształtu. Proces ten może być zatem wykorzystywany
do rozdzielenia mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości (Rys.3).
3
 Rys.3
Rozdzielanie mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości.
Małe liniowe fragmenty poruszają się szybciej niż większe, których ruch jest silniej hamowany przez
plątaninę włókien agarozy tworzących żel. Szybkość, z jaką przesuwa się w żelu cząsteczka DNA jest
odwrotnie proporcjonalna do jej masy cząsteczkowej. Umieszczenie w niektórych studzienkach
fragmentów DNA o znanej wielkości (tzw. wzorców DNA) pozwala na dokładny pomiar masy
cząsteczkowej badanych fragmentów. Dodany do próbek barwnik (najczęściej błękit bromofenolowy)
pozwala na śledzenie przebiegu elektroforezy. DNA uwidaczniane jest za pomocą stosowanego
rutynowo bromku etydyny, który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (Rys.4)
(powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Po wzbudzeniu światłem
nadfioletowym barwnik ten intensywnie fluoryzuje, emitując światło o pomarańczowym zabarwieniu.
Należy pamiętać, że obecność związku interkalującego do DNA w żelu agarozowym zmniejsza
ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. Innym barwnikiem DNA jest np. SYBR Green,
którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25 razy większa niż EtBr.
Rys.4
Związany z DNA bromek etydyny fluoryzujący w świetle UV.
Wielkość liniowych fragmentów DNA o nieznanej masie można również ustalić na podstawie krzywej
wzorcowej, sporządzonej dla fragmentów DNA o znanej długości (tzw. wzorców DNA; patrz Rys.6).
Krzywa kalibracyjna przedstawia zależność między długością tych fragmentów (pz) a odległością
przebytą przez nie podczas elektroforezy (mm). Porównując ruchliwość elektroforetyczną wzorców (w
żelu o tej samej procentowości) z ruchliwością nieznanego fragmentu DNA można na podstawie
wykresu oszacować z dość dużą dokładnością jego długość.
4
Szybkość elektroforetycznej migracji DNA w żelu agarozowym jest zależna od następujących
parametrów:
1.
Masa cząsteczkowa DNA
: cząsteczki liniowe migrują w żelu z szybkością, która jest
proporcjonalna do log
10
z ich masy cząsteczkowej.
2.
Stężenie agarozy
: dany fragment DNA o określonej wielkości migruje z różną szybkością w
żelu zawierającym rożne stężenia agarozy. Istnieje liniowa zależność pomiędzy logarytmem
elektroforetycznej ruchliwości DNA w żelu (µ) i stężeniem agarozy (γ), która jest wyrażona
równaniem:
logµ=logµ
0
- K
r
γ
gdzie µ
0
jest swobodną elektroforetyczna ruchliwością DNA, a K
r
oznacza współczynnik
spowalniania (const.), który jest związany z właściwościami żelu oraz z wielkością i kształtem
migrujących cząsteczek. Dlatego przy użyciu żeli o różnym stężeniu agarozy możliwy jest
rozdział fragmentów DNA o bardzo szerokim zakresie wielkości cząsteczek (mas
cząsteczkowych) (Tab.1). Wadą elektroforezy w żelu agarozowym jest natomiast słaba
rozdzielczość frakcji DNA różniącego się o mniej niż 5% wielkości.
Stężenie
agarozy
w żelu (%)
Zakres długości
rozdzielanego
liniowego DNA
(wielkość w tys. par zasad)
[z ang. kb
]
0,3
5-60
0,6
1-20
0,7
0,8-10
0,9
0,5-7
1,2
0,4-6
1,5
0,2-3
2,0
0,1-2
T
ab.1
Zakres rozdziału linearnego DNA w zależności od stężenia agarozy w żelu.
3.
Konformacja DNA
: forma I - superzwinięte (CCC), forma II – nacięte koliste (OC) i forma
III- liniowe (L) cząsteczki DNA o tej samej masie migrują w żelu z różną szybkością.
Względna ruchliwość tych trzech form zależy głównie od stężenia agarozy w żelu oraz od
wielkości przyłożonego natężenia prądu, siły jonowej buforu i od gęstości superhelikalnych
skrętów w cząsteczce DNA formy I. W pewnych warunkach DNA formy I migruje szybciej
niż forma III, w innych warunkach kolejność może być odwrócona. Dość dobrą metodą dla
identyfikacji rożnych konformacyjnych form DNA jest rozdział elektroforetyczny w
obecności wzrastającej ilości bromku etydyny. Przy wzroście stężenia bromku etydyny więcej
barwnika wiąże się z DNA. Skręty cząsteczki DNA formy I są sukcesywnie likwidowane , a
szybkość migracji cząsteczek ulega zwolnieniu. Przy krytycznym stężeniu barwnika szybkość
migracji cząsteczki DNA w formie I osiąga swoją minimalna wielkość. Jeżeli stężenie bromku
będzie nadal zwiększane, powstają skręty przeciwnej orientacji, a ruchliwość DNA formy I
zwiększa się szybko. Ruchliwość formy II i III zmniejsza się w różny sposób w wyniku
neutralizacji ładunków i dużej sztywności nadawanej cząsteczce DNA przez bromek etydyny.
Dla większości rozdziałów cząsteczek formy I DNA krytyczne stężenie wolnego bromku
etydyny mieści się w zakresie 0,1-0,5 µg/ml.
4.
Natężenie pola elektrycznego
: przy niskim natężeniu pola, migracja fragmentów liniowych
DNA jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Jednakże przy wzroście natężenia pola
elektrycznego ruchliwość fragmentów DNA o dużej masie cząsteczkowej nie wzrasta w
sposób proporcjonalny. Dlatego efektywny zakres rozdziału w żelu agarozowym zmniejsza się
ze wzrostem napięcia. Aby uzyskać maksymalny rozdział fragmentów DNA, natężenie pola
nie powinno przekraczać 5V/cm.
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]